Nano tRNA sequencing都能检测哪些修饰？

      我们的nano tRNA 测序试剂盒能够对完整长度的 tRNA 进行测序，以及对相应的修饰进行检测。其检测修饰的原理是当tRNA链上的每一个核苷酸（碱基）在通过纳米孔时，会因其化学结构和大小的差异，产生特征性的电流信号。当碱基被化学修饰（如甲基化）后，其物理化学性质改变，从而导致通过纳米孔时的电流信号与未修饰的经典碱基（A, U, C, G）不同。也就是说，如果我们将其信号与A, U, C, G参照信号进行比读，那些异常信号将被视为此处的碱基发生了修饰。

     对于数据分析而言，修饰有两种，一种是通过完美训练好的算法（即“碱基识别器”，basecaller， nano tRNA利用的是牛津纳米孔测序的Dorado碱基识别器）能直接根据电流信号“读出”这个碱基是什么修饰，比如是“A”还是“m6A”；目前nano tRNA能直接读出的有9种：5mCG、5mCG-5hmCG、6mA、5mC-5hmC、4mC-5mC、m6A_DRACH、preU、inosine-m6A、m5C。

      另一类修饰是不在上面的9种修饰之列。这时候就要靠间接推断来确认修饰。

     这类间接推断，是数据处理的核心分析工作。也就是说就算Dorado不能直接命名某种修饰，只要该修饰存在于某个已知的tRNA位点（例如，tRNA的第34位反密码子摆动位置常发生修饰），并且该修饰会改变电流信号，那么它就会在该位置产生一个可检测的“信号扰动”。以下是一般的分析流程

已知位点：客户必须事先知道他们感兴趣的修饰具体发生在哪个tRNA的哪个核苷酸位置（例如，tRNA-Leu-CAA 第37位的m1G）。

分析信号：在纳米孔测序数据中，定位到该特定tRNA的该特定位置。

比较差异：分析该位置在两种实验条件下的“不匹配率”、“缺失率”或信号特征（如电流均值、方差等）是否存在统计学上的显著差异。

得出结论：如果差异显著，则可以推断该位置的修饰水平可能发生了变化。虽然不能100%确认就是目标修饰（因为理论上其他未知变化也可能影响信号），但在生物学背景已知的情况下，这可以算一个强有力的间接证据。

当然客户也可以为任何修饰训练一个专门的basecaller模型，扩充Dorado的识别修饰列表，但这需要 1）大量已知含有和不含该修饰的标准RNA序列作为训练集；2）强大的计算资源和机器学习专业知识。 这目前是我们不能提供的。

因此，对于进行nano tRNA测序的客户，最佳的选择是将繁琐的数据分析工作交给我们。

参考资料：

https://www.immaginabiotech.com/media/22/40/f8/1740474693/BioIT%20guidelines_DeMuxnanoT.pdf

https://www.nature.com/articles/s41587-023-01743-6

https://www.immaginabiotech.com/media/71/be/cf/1741359677/nano-tRNA%20seq%20app%20%20note.pdf

https://www.immaginabiotech.com/media/8c/88/ca/1732263196/nano_tRNAseq_service_report.html

https://www.immaginabiotech.com/media/9d/cb/ac/1756887478/Nano-tRNA_protocol_v1.5.pdf